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聚乙烯亞胺PEI-Pro(GMP)的操作與維護(hù)指南

更新時(shí)間:2024-12-19      點(diǎn)擊次數(shù):221
  聚乙烯亞胺PEI-Pro(GMP)是一種GMP級(jí)別的轉(zhuǎn)染試劑,其操作與維護(hù)指南主要包括以下內(nèi)容:
  一、操作指南
  1.貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作
  以6孔板轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞為例:
  轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備:
  轉(zhuǎn)染前一天:用膠原酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)(不建議用胰酶)。按照每孔2×10^6的細(xì)胞量接種293T至6孔板(每孔加入2ml新鮮的DMEM:F12+5%FBS培養(yǎng)基和1ml的細(xì)胞懸液),置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。
  24小時(shí)后,移除之前培養(yǎng)基,每孔加入2ml新鮮的DMEM:F12+5%FBS。注意確保293T細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,傳代不超過(guò)15代。
  第一天:顯微鏡下檢查細(xì)胞匯合度,當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%到80%的匯合度時(shí),開(kāi)始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。
  轉(zhuǎn)染步驟:
  對(duì)于每孔細(xì)胞,用100μl無(wú)血清培養(yǎng)基(如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基)稀釋DNA,使DNA終濃度為1ug/ml(DNA/總培養(yǎng)體積)。
  對(duì)于每孔細(xì)胞,用100μl無(wú)血清培養(yǎng)基(如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基)稀釋適當(dāng)比例的適量BIOHUB-PRO GMP。DNA與BIOHUB-PRO GMP的比例要根據(jù)實(shí)驗(yàn)摸索最適比例。
  將稀釋的BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中(總體積200μL),輕輕混勻,室溫孵育30分鐘。
  小心地將BIOHUB-PRO GMP復(fù)合物滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。注意加入混合液時(shí)輕輕沿著孔板邊緣滴入,避免破壞細(xì)胞的粘附性。
  將培養(yǎng)板放入37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
  觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果:
  第二天:在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,通常超過(guò)80%的293T細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的24小時(shí)可以觀察到綠色熒光。
  2.懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作
  以293F細(xì)胞于100mL培養(yǎng)瓶(溶液體積占瓶體積的1/5)操作體系為例:
  細(xì)胞培養(yǎng):
  HEK293F細(xì)胞傳代接種于20mL懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中,在36.5℃、120rpm、5%CO2的條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10^6cells/mL時(shí),旋緊瓶口放入搖床繼續(xù)培養(yǎng),2~4小時(shí)后可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
  轉(zhuǎn)染步驟:
  用1mlOptiPRO?SFM(無(wú)血清培養(yǎng)基)稀釋適量的DNA,使DNA終濃度為1ug/ml(DNA/總培養(yǎng)體積)?;靹虿㈧o置5分鐘。
  用1mlOptiPRO?SFM(無(wú)血清培養(yǎng)基)稀釋適當(dāng)比例的BIOHUB-PRO GMP,混勻并靜置10分鐘。
  將BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中,輕輕混勻,室溫孵育30分鐘。
  將BIOHUB-PRO GMP轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中,搖勻后旋緊瓶口放回?fù)u床(36.5℃、5%CO2、120rpm)。
  基因表達(dá)檢測(cè):
  基因表達(dá)可在24~72小時(shí)后檢測(cè),具體時(shí)間取決于細(xì)胞系和轉(zhuǎn)基因。
 

 

  二、維護(hù)指南
  1.儲(chǔ)存條件
  PEI-Pro(GMP)轉(zhuǎn)染試劑建議儲(chǔ)存在低溫環(huán)境中,如4℃冰箱或-20℃冰凍條件下。低溫環(huán)境能夠有效延緩PEI分子結(jié)構(gòu)的降解,保持其穩(wěn)定性。
  避免PEI溶液的反復(fù)凍融,以保持其最佳狀態(tài)。
  2.使用注意事項(xiàng)
  PEI-Pro(GMP)轉(zhuǎn)染試劑的使用濃度是實(shí)驗(yàn)效果的關(guān)鍵因素之一。一般建議將PEI溶液稀釋至適合的工作濃度后立即使用,避免長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存稀釋后的溶液。
  不同的細(xì)胞類型對(duì)PEI濃度的敏感度不同,實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)根據(jù)具體細(xì)胞的需求進(jìn)行優(yōu)化,以提高轉(zhuǎn)染效率。
  若發(fā)現(xiàn)PEI溶液出現(xiàn)沉淀、渾濁或顏色變化,可能意味著其已發(fā)生降解,建議此時(shí)更換新的試劑,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
  3.定期驗(yàn)證
  長(zhǎng)期保存的PEI-Pro(GMP)轉(zhuǎn)染試劑在使用前應(yīng)進(jìn)行小規(guī)模實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率是否依然符合要求,這樣可以避免浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)材料和時(shí)間。
  4.更新與替換
  對(duì)于經(jīng)常需要使用PEI-Pro(GMP)轉(zhuǎn)染試劑的實(shí)驗(yàn)室,建議定期更新儲(chǔ)存的試劑,并按照生產(chǎn)商的建議進(jìn)行正確的儲(chǔ)存和使用。
  通過(guò)以上操作與維護(hù)指南,可以確保聚乙烯亞胺PEI-Pro(GMP)轉(zhuǎn)染試劑在細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的有效性和穩(wěn)定性,提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。
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